Sanger Dizileme ve Yeni Nesil Dizileme Teknolojisi

Giriş

DNA dizileme DNA molekülündeki nükleotitlerin (A, T, C, G) kompozisyonunu ve diziliş sırasını belirleme olarak tanımlanmaktadır [1]. DNA dizileme metodu, ilk olarak 1975’te Sanger ve 1976 yılında Maxam-Gilbert tarafından ayrı ayrı geliştirilmiş ve genetik alanında çığır açmıştır. Sonrasında gen dizisinin daha uzun okumalarla, daha kısa sürede ve çok daha yüksek doğrulukta ortaya çıkarılmasına yönelik çalışmalar artmış ve bunun üzerine birçok platform geliştirilmiştir. Frederick Sanger’in geliştirdiği metot, 1. nesil dizileme olarak gruplandırılırken 2. nesil ve sonraki nesil dizileme yöntemleri yeni nesil dizileme içerisine dahil edilmiştir [2].

Sanger Dizileme

1975 yılında Frederick Sanger tarafından geliştirilen bu teknik Sanger’e 1980 yılında kimya alanında ikinci defa Nobel Ödülü’nü kazandırmıştır.  2003 yılında sonuçları paylaşılan İnsan Genom Projesi’nin büyük bir kısmı Sanger dizileme cihazları kullanılarak tamamlanmıştır [3].

Zincir sonlanması temeline dayanan bu teknikte amaç DNA fragmanlarının, jel üzerindeki uzunluklarının dikkate alınarak DNA molekülünün baz kompozisyonunu ve dizilişini ortaya çıkarmaktır. Di deoksi DNA dizileme olarak da bilinen bu teknikte, DNA kalıbına bağlı bir polimeraz, tek zincirli DNA’nın tamamlayıcı zincirini yapmak üzere ortamda bulunan dNTP ve ddNTP ve primerleri kullanarak uygun pH ortamında farklı uzunlukta DNA fragmanlarını üretir [4]. Reaksiyon 4 ayrı tüpte yapılır. Her bir tüpte dNTP’lerin tamamı, çok düşük konsatrasyonda da farklı bir ddNTP kullanılır. Her tüpte gerçekleşen PCR reaksiyonunda kullanılan dNTP’ler eklenirken reaksiyon devam ederken, 3’ OH grubundan yoksun olan ddNTP’ler zincire eklendiğinde reaksiyon durur. ddNTP’lerin bağlandığı farklı konumlarda reaksiyon sonlandığı için farklı uzunluklarda DNA fragmanları oluşur. PCR sonrasında oluşan amplikonlar jel elektrofarezinde görüntülenir  (Şekil 1) [5].

Moleküler tanı alanında birçok teknoloji geliştirilse de Sanger sekanslama yeni geliştirilen moleküler tanılarda ikincil bir doğrulama yöntemi olarak hala kullanılmaktadır.

Yeni Nesil Dizileme (YND)

İnsan genom projesinin tamamlanmasıyla birlikte DNA dizileme alanında birçok platform geliştirilmiştir. Bu platformların tamamı Yeni Nesil Dizileme (YND) yöntemi içinde gruplandırılmaktadır. Aynı anda milyonlarca DNA fragmanının paralel olarak dizilenmesini sağlayan YND yöntemi, geliştirilen teknolojiler ile moleküler genetik alanında çığır açmış; çok daha yüksek verimli, yüksek doğrulukta DNA verisi elde edilmesine olanak tanımıştır. Ayrıca gelişen teknolojiler ile megabaz başına düşen maliyet ortalama 1000$ seviyesine kadar düşmüştür [3, 6].

Yeni nesil dizileme içerisine dahil olan ikinci nesil ve üçüncü nesil dizileme yöntemlerinin, birbirine göre avantaj ve dezavantajları vardır. Birinci ve ikinci nesil dizileme yöntemine göre üçüncü nesil dizileme verimde daha yüksek oran, geri dönüş süresinin daha hızlı olması (dakika içinde yüksek miktarda metilatlı genom dizisinin eldesi), uzun okuma oranının artışı, başlangıç materyalinin doğru çoğaltılması ve küçük miktarda başlangıç materyalinin yeterli olması ve daha düşük maliyetli olması açısından daha avantajlıdır [7].

YND yönteminin gelişip maliyetinin ve sürenin azalmasıyla kullanılmaya başlandığı alanlar gittikçe artmıştır. Mevcut olarak YND’nin kullanım alanları şu şekildedir: i)Nadir hastalıklara neden olan mutasyonların ve yeni genlerin keşfi ii) Fenotipik ve genotipik olarak heterojenite gösteren hastalıkların tanısı iii) Transkriptomik iv) Epigenetik çalışmalar v) Mikrobiyoloji vi) Adli tıp.

YND Platformları

Birçok ticari firma farklı YND yöntemlerini kullanan platformlar geliştirmiştir. Bu platformlar sayesinde okunan milyonlarca baz dijital ortamda çeşitli biyoinformatik araçlar kullanılarak işlenir ve genoma eşlenerek varyant araması yapılır. İnsan genomundaki 3 milyar baz çifti defalarca okunarak dizi bilgisi çıkarılabilirken bu ölçek sınırlandırılarak şu an bilinmekte olan 22 000 gene yönelik de bir dizileme yapılabilir. Ayrıca sadece bir hastalıkla ilişkili olduğu bilinen klinik açıdan önemli bir grup gen veya ekzonlar toplu olarak dizilenebilmektedir [6].

Roche 454 Pirodizileme

İlk olarak 2004’te ortaya çıkan bu platform, lusiferaz tarafından oksilusiferinin parçalanması sonucu ışık üreten bir downstream reaksiyon grubunu oluşturmak için DNA polimeraz tarafından nükleotit eklenmesi sonrasında salınan pirofosfat molekülünü kullanan ‘piro-dizileme’ temeline dayanır. İzole edilen DNA restriksiyon enzimleri kullanılarak 200-600 bp uzunluğundaki fragmanlar haline getirilir. Diğer platformlardan farklı olarak, mikrotitre plakalarda veya ayrı tüplerde dizileme yapmak yerine, üzerinde adaptörlere tamamlayıcı olan milyonlarca oligomer içeren yüzbinlerce manyetik boncuk üzerinde DNA zincirleri emülsiyon PCR ile çoğaltılır. Emülsiyon PCR’da, PCR bileşenlerini de içeren sulu miseller içinde, her biri oligomerlerle donatılmış tek bir benzersiz DNA fragmanına sahip olan agaroz taneciklerini dış ortamdan ayırmak içi karıştırılmış bir yağ ve sulu karışım kullanılır. Her bir agaroz boncuk yüzeyi adaptörlere komplementer olan 1000000 oligomer içerir. Bu özelliklere sahip yüzbinlerce boncuk emülsiyon PCR yapıldıktan sonra pikotiter plakasının (PTP) yüzeyine eklenir ve ardından üzerine sekans için gerekli aktif enzimlere bağlanan 1 mikrometre çapında çok daha küçük manyetik boncuklar eklenir. PTP aynı zamanda pirodizileme reaktanlarının aktığı hücre haline geldiğinden sekans cihazına yerleştirilir; nükleotitler ve reaktanları sırayla (A, C, G, T) PTP üzerine bırakılır. Her bir nükleotid reaktanlarıyla beraber bırakıldığında nükleotit zincire eklenirse lüsiferaz aktivitesi meydana gelir ve ışık meydana gelir. Yayılan ışık dedektörden algılanır. Dedektörden algılanan ışık miktarı ile dizideki nükleotit sayısı doğru orantılıdır. Işığın yoğunluğuyla nükleotit sayısının hesaplanabilmesi için adaptör dizisine, ilk dört nükleotit akışının dizisiyle eşleşen tanımlı bir tek nükleotid modeli yerleştirilir. Bu, 454 analiz yazılımının tek bir nükleotid birleşmesinden yayılan ışığın seviyesini kalibre etmesini sağlar. Mevcut 454 cihazı olan GS-FLX, 7 saatlik çalışma başına ∼100 Mb dizi verisi birleşik çıktısı ile numune başına (boncuk başına) ∼250 bp ortalama okuma uzunluğu üretir (Şekil 2) [8].

Illumina

2006’da geliştirilen bu platform sentez yoluyla sekans (SBS) temeline dayalı bir dizileme teknolojisidir. Illumina sekans temel olarak 4 işlemden meydana gelmektedir: 1.DNA hazırlığı 2.Küme Oluşturma 3.Sekanslama 4.Veri Analizi (Şekil 3).

Örnek Hazırlığı 

DNA veya RNA izolasyonu yapıldıktan sonra PCR veya fragmantasyon ile 200-600 baz çifti uzunluğunda fragmanlar oluşturulur. DNA/RNA fragmanları sekans cihazına yüklenmeden önce uçlarına adaptör takılır. Adaptörlere bağlanan DNA parçaları daha sonra tek iplikli hale getirilir. Bu, fragmanların sodyum hidroksit ile inkübe edilmesiyle yapılır.

Küme Oluşturma 

8 eşit şeride bölünmüş akışkan bir yüzey üzerinde DNA fragmanlarının uçlarındaki adaptörlere komplementer olan oligolar bulunmaktadır. Hazırlandıktan sonra DNA parçaları akış hücresi boyunca yıkanır. Tamamlayıcı DNA, akış hücresinin yüzeyindeki primerlere bağlanır ve bağlanmayan DNA yıkanır. Akış hücresine bağlanan DNA daha sonra aynı diziye sahip küçük DNA kümeleri oluşturmak üzere kopyalanır. Daha sonra, akış hücresine bağlı DNA ipliklerini uzatmak ve birleştirmek için etiketlenmemiş nükleotid bazları ve DNA polimeraz eklenir. Bu, akış hücresi yüzeyindeki primerler arasında çift sarmallı DNA ‘köprüleri’ oluşturur. Çift sarmallı DNA daha sonra ısı kullanılarak denatüre edilir ve birkaç milyon yoğun özdeş DNA dizisi kümesi bırakır.

Sekans 

Küme oluşumu sonrasında floresanla işaretli sonlandırıcı nükleotitler ve primerler ortama bırakılır. Primerler kalıp zincire bağlandıktan sonra polimeraz işaretli nükleotitleri zincire ekler. Her bir nükleotit kendine özgü bir floresan terminatör grupla işaretlenmiştir. Terminatör floresanla işaretli nükleotit zincire eklendiğinde reaksiyon durur. Sonrasında lazer floresandaki ışığı aktif hale getirir ve ortaya çıkan ışık dedektör tarafından algılanır. Floresan olarak etiketlenmiş sonlandırıcı grup daha sonra birinci bazdan çıkarılır ve bir sonraki floresan olarak etiketlenmiş sonlandırıcı bazın eklenmesine izin verilir. Böylece bu süreç milyonlarca küme sekanslanıncaya kadar devam eder.

Veri Analizi 

DNA dizisi, Illumina sekansı sırasında baz baz ve yüksek doğrulukla analiz edilir ve oluşturulan dizi daha sonra bir referans diziye hizalanır. Bu sekanslanmış DNA’daki eşleşmeleri veya değişiklikleri arar. Sekans cihazından BCL dosya formatında çıkan ham veri biyoinformatik araçlarla kalite skorlaması yapılarak işlenir; de novo birleştime yapılır ve referans genoma eşlenir [8].

Oxford Nanopore

2014 yılında geliştirilen Oxford Nanopore platformu PCR gerektirmeyen bir yöntemle, tek zincirli DNA veya RNA molekülünün pordan geçişiyle oluşan voltaj farkının ölçülmesine dayalı bir dizileme yöntemidir. Çift zincirli DNA’nın veya RNA zincirlerinin ucuna adaptör ve motor protein bağlanır. Sonrasında voltaja dayanıklı bir membrana gömülü olan alfa hemolizin yapısında olan bir pordan tek zincirli halde geçerek membran üzerinde voltaj farkı meydana getirir. Her nükleotit türünün meydana getirdiği voltaj değişimi birbirinden farklıdır. Dedektörler tarafından algılanan voltaj farklılığı ile dizi içerisinde bulunan baz sırası ve kompozisyonu belirlenir. DNA veya RNA nanopordan geçerken anlık olarak okunduğundan araştırıcıya gerçek zamanlı veri verir (Şekil 4).

Oxford Nanopore platformunun en büyük avantajlarından bir tanesi geliştirmiş olduğu ve bu görevi gören MinION kartuşunun sadece 100 gram ağırlığına olması ve USB ile bilgisayara bağlanabilmesidir [8].

Pacbio

2009’da Pacific Biosciences tarafından geliştirilen Pacbio platformu tek molekülden gerçek zamanlı sekans (SMRT) yapan bir dizileme yöntemidir. SMRT dizilemede senteze dayalı sekans temel alınır. SMRT dizilemede hedef DNA’nın replikasyonu sırasında sekans bilgisi alınır. Dizilenecek hedef molekül, SMRT’bell olarak adlandırılan, adaptörler tarafından ligasyon yoluyla birleştirilmiş ve sonucunda halkasal yapı kazanmış tek zincirli DNA molekülüdür.

SMRT’bell molekülü ışıktan tamamen izole kuyucuklara yüklenir ve her bir kuyucukta bir tane yerleşmiş halde bulunan bir polimeraz tarafından replikasyona uğrar. Replikasyon sırasında kullanılan nükleotitlerin her biri farklı renkte floresan ile işaretlenmiştir. Zincire eklenen her bir nükleotit kendine has floresan ışıma yapar (Şekil 5) [8, 12]. Pacbio dizilemenin en büyük avantajı okuma uzunluğudur. İlk geliştirilen SMRT platformu platform 1500 bp’ye kadar tek seferlik okuma yaparken bu sayı geliştirmelerle 15 kb’ye kadar çıkabilmektedir [13].

Kaynaklar:

1. Zuckerkandl, E. and L. Pauling, Evolutionary divergence and convergence in proteins, in Evolving genes and proteins. 1965, Elsevier. p. 97-166.
2. Hagemann, I.S., Overview of technical aspects and chemistries of next-generation sequencing. Clinical Genomics, 2015: p. 3-19.
3. DOĞAN, M., et al., Yeni Nesil Dizileme (YND) Hakkında Bilinenler (Literatür Taraması). Duzce Medical Journal, 2017. 19(1): p. 27-30.
4. Valencia, C.A., et al., Sanger Sequencing Principles, History, and Landmarks, in Next Generation Sequencing Technologies in Medical Genetics. 2013, Springer. p. 3-11.
5. Gauthier, M.G., Simulation of polymer translocation through small channels: A molecular dynamics study and a new Monte Carlo approach. 2008, University of Ottawa (Canada).
6. Behjati, S. and P.S. Tarpey, What is next generation sequencing? Archives of Disease in Childhood-Education and Practice, 2013. 98(6): p. 236-238.
7. Bolukbasi, E. and E.S. Aras, Third generation DNA sequencing technologies. DNA, 2015. 1(3).
8. Bruijns, B., R. Tiggelaar, and H. Gardeniers, Massively parallel sequencing techniques for forensics: A review. Electrophoresis, 2018. 39(21): p. 2642-2654.
9. Illumina, I., An introduction to next-generation sequencing technology. 2015.
10. He, M., X. Chi, and J. Ren, Applications of Oxford Nanopore Sequencing in Schizosaccharomyces pombe, in Yeast Protocols. 2021, Springer. p. 97-116.
11. Mardis, E.R., The impact of next-generation sequencing technology on genetics. Trends in genetics, 2008. 24(3): p. 133-141.
12. Børsting, C. and N. Morling, Next generation sequencing and its applications in forensic genetics. Forensic Science International: Genetics, 2015. 18: p. 78-89.
13. Rhoads, A. and K.F. Au, PacBio sequencing and its applications. Genomics, proteomics & bioinformatics, 2015. 13(5): p. 278-289.

Görsel Kaynak: https://www.cshl.edu/press-news/new-book-on-next-generation-sequencing-in-medicine-from-cshl-press/

Editör: Ecem Bolat