in

ÇalışkanÇalışkan HavalıHavalı Sevgi DoluSevgi Dolu EntellektüelEntellektüel ŞaşkınŞaşkın ÇılgıncaÇılgınca

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR): Mekanizması ve Basamakları

Giriş

1983’de Karry Mullis tarafından keşfedilen ve keşfinden 10 yıl sonra mucidine Nobel ödülü kazandıran PCR tekniği, (koronavirüs testlerinden de adını sıkça duyduğumuz üzere) tanı ve epidemiyolojik çalışmalarda kullanılmaktadır. DNA üzerinde istenen bölgenin in vitro koşullarda enzimatik amplifikasyonunu sağlaması ve bakterilere gereksinim duyulmadan replikasyona olanak tanıması sayesinde moleküler biyoloji, genetik mühendisliği, mikrobiyoloji ve daha birçok dalda giderek genişleyen bir kullanım alanına sahiptir.

Mekanizma

PCR metodu, çift zincirli DNA (dsDNA)’nın yüksek sıcaklıklarda denatüre edilerek tek zincirli hale (ssDNA) getirilmesi ‘denatürasyon’; hedef DNA zincirine spesifik sentezlenmiş oligonükleotid primerlerin DNA’ya bağlandığı ‘primer eşleşmesi (annealing)’ ve DNA’ya bağlanan primerin optimum sıcaklık ve pH ortam koşullarında dNTP’ler ile uzadığı basamak olan ‘primer uzaması (extension)’ olmak üzere 3 basamaktan oluşur. Her döngü sonunda sentezlenen DNA zinciri bir sonraki döngüde kalıp görevi görebilmektedir. Bu sayede sentezlenen DNA zinciri sayısı üssel olarak artar. PCR sonucu elde edilen ürün miktarı (2n-2n) X formülü ile ifade edilir. Burada ‘n’ döngü sayısı, ‘2n’ birinci ve ikinci döngü sonucu oluşmuş uzunluğu bilinmeyen ürünler, ‘X’ ise kalıp DNA’nın kopya sayısıdır.

Şekil 1: DNA’nın PCR yöntemi ile çoğaltılması

Denatürasyon (Denaturation)

Çift zincirli formda olan DNA’nın denatürasyonunu sağlamak amacıyla yüksek sıcaklıklar kullanılır. Denatürasyon sıcaklığı ortamda bulunan iyon derişiminden, çözücülerden, dizide bulan G+C bazlarının oranından etkilenmektedir. Bu koşullarda göz önünde bulundurularak en etkin sıcaklığın 91-96 °C arasında olduğu saptanmıştır. Denatürasyon basamağının süresi 1-2 dk.’dır. Ortamdaki tüm dsDNA’lar ssDNA formuna döndüğünde basamak tamamlanır. Kalıp DNA zincirlerinin tam olarak denatüre olmaması verim kaybına sebep olmaktadır. PCR’da Taq-Polimeraz gibi sıcaklık toleransı yüksek DNA polimerazlar kullanılsa da denatürasyon sürenin uzaması enzimin aktivitesini düşürebilmektedir.

Primer Eşleşmesi (Annealing)

Bu basamakta DNA dizisine spesifik olarak sentezlenmiş 20-30 nükleotid uzunluğunda olan primerler, ssDNA formuna (tek zincirli) geçmiş kalıp zincirlere bağlanır. Reaksiyon sıcaklığı denatürasyon basamağına kıyasla düşüktür (52-72 °C). Primerlerin bağlanması için uygun sıcaklık Tm/bağlanma sıcaklığı olarak adlandırılır. Bu sıcaklığın optimize edilmesi PCR reaksiyonunun gerçekleşebilmesi açısından oldukça önemlidir.  Yaklaşık bir değer bulmak için Tm= [(G+C) x °C + (A+T) x 2 °C] formülü kullanılsa da çoğu zaman daha düşük sıcaklıklar Tm değeri olarak seçilir ve optimum sıcaklık değeri denemeler sonucunda tespit edilir. Bu basamak için gerekli süre ise sıcaklık ve primerlerin baz içeriği gibi etkenlere bağlı olarak değişmektedir. Düşük sıcaklıklarda çalışıldığında primer dimerleri gibi spesifik olmayan DNA fragmentleri oluşabilir.

Primer Uzaması (Extension)

Bu basamakta tek zincir halinde bulunan kalıp DNA, yüksek sıcaklık koşullarında etkinlik gösterebilen DNA polimerazlar (genellikle Taq-Polimeraz) aracılığıyla primerlerin uçlarına 5’-> 3’ yönünde dNTP’ler eklenerek çift zincirli hale getirilir. Reaksiyon için optimum sıcaklık 70-72 °C’dir. Bu basamak için yaklaşık 2 dakika yeterli olmakla beraber kalıp DNA’nın uzunluğuyla doğru orantılı olarak değişebilir. Toplam siklus sayısı genelde 25-35 arasındadır. Siklus sayısının arttırılması da yine primer dimerleri gibi istenmeyen ikincil ürünlerin oluşumuna sebep olabilir. PCR’a dair hesaplamalarda teorik olarak verim %100 olarak düşünülse de deneysel koşullarda verim %85 kadardır.

 Kısaltmalar:

  • dsDNA: Double – Stranded DNA (Çift Zincir DNA)
  • ssDNA: Single – Stranded DNA (Tek Zincir DNA)
  • Taq: Thermus aquaticus
  • dNTP: Dideoksinükleotitler
  • Tm Değeri: Melting Temperature (Erime Değeri)

 Kaynaklar:

  1. https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20TR/bolum6.pdf 
  2. https://avys.omu.edu.tr/storage/app/public/harun.albayrak/121582/Molek%C3%BCler%20Teknikler.pdf
  3. KAHYA, S., BUYUKCANGAZ, E., CARLI, K., 2013, “Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Optimizasyonu”, Uludag University Faculty of Veterinary Medicine Microbiology, 32 (2013), 1: 31-38
  4. TEMİZKAN, G., ARDA, N., 2017, “TEMEL ve İLERİ MOLEKÜLER BİYOLOJİ YÖNTEMLERİ”, Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul

Görsel Kaynaklar:

  1. https://slideplayer.com/slide/10073863/
  2. https://yandex.com.tr/gorsel/search?text=dna&pos=34&img_url=https%3A%2F%2Fsun9-21.userapi.com%2Fc626830%2Fv626830122%2F1383b%2FcSj4LY3f1CM.jpg&rpt=simage 

Editör: Tolga Polat

Ne düşünüyorsunuz?

106 Points
+ Oy - Oy

Bir cevap yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir

    8 Yorum

    1. Başarılarinizin devamını dilerim.gen teknolojisinin ve bu teknolojide kullanılan ensrümental analizlerin temel tekniklefinden biridir.çalışmaları ızda başarı ve kolaylıklar dilerim