Western Blot Yöntemi

İçindekiler

Tanım

Protein izolasyonu yapılmadan önce izole edilecek olan proteinin saflaştırılması gerekir. İzole edilecek olan proteinin yapısı, işlevi ve diğer proteinlerle olan etkileşiminin karakterizasyonu için saflaştırılır. İlk olarak biyolojik doku ve mikrobiyal kültüre ihtiyaç duyulur. Saflaştırma işlemi sonunda protein bulunduğu ortamdan çıkarılır. Protein ve diğer kısımlar olarak ayrım yapılır. Protein ayrıştırma işlemi esnasında proteinlerin büyüklükleri, fizikokimyasal özellikleri, afinitesi ve biyolojik özelliklerine göre ayrım yapılır. Saflaştırma teknikleri analitik veya preparatif olabilir. Preparatif saflaştırma işleminde büyük miktarda protein üretimi hedeflenir. Buna gıdasal proteinler, biyofarmasötikler ve enzimler örnek verilir. Analitik saflaştırma işlemi için protein küçük miktarda olabilir, analiz ya da araştırma amaçlı üretim yapılabilir. Kristalize edecek seviyede saflaştırabilen enzimler üreaz ve pepsindir.

Saflaştırma işleminde en önemli seçim başlangıç malzemesini seçmektir. Bir hayvan ya da bitkinin gövdesinde bulunan protein homojen olarak dağılmaz. Protein konsantrasyonu farklı organ ya da dokularda çok ya da daha az olabilir. Analitik saflaştırmada genellikle proteinler için üç özellikten yararlanılır. Proteinler pH gradiyentli jelle ya da iyon değişim kolonu kullanarak izoelektrik noktalarına göre ayrılırlar.

SDS-PAGE ile ise proteinler boylarına ya da ağırlıklarına göre ayrılırlar. Proteinler ters faz kromatografisiyle hidrofobisite veya polaritelerine göre ayrılırlar. Proteinler genellikle iki boyutlu poliakrilamid jel elektroforez (2B-PAGE) yöntemi ile saflaştırılır, ardından da kütle spektrometresi peptit parmak izlemesi kullanılarak kimlikleri tespit edilir. Bu yöntem için protein miktarının nanogram olması yeterlidir. Saflaştırma işlemlerinde kullanılan en genel yöntem farklı adımlarda SDS-PAGE’nin kullanılmasıdır. Kullanılan bu yöntemle çeşitli proteinlerin miktarı hakkında bilgi verir. Aynı molekül kütleye sahip olan proteinlerin ayırt edilmesi oldukça zordur. Proteinin ayırt edici spektroskopik özelliği ya da enzim kinetiği varsa bu özelliklerden faydalanarak nicel olarak protein tayini yapılabilir. Proteini tanıyan antikor varsa, western blot ve ELISA yöntemleri kullanılarak istenilen protein nicelik özelliklerine göre tespit edilebilir. Bazı proteinlerin reseptör işlevi vardır.

Saflaştırma işlemlerinde ligand bağlanma ölçümü kullanılarak protein varlığı tespit edilebilir. Elde edilen protein antikora bağlıysa protein bağlanma oranı ölçülebilir. Bu yöntemle toplam protein miktarı belirlenebilir. Protein saflaştırma preparatif ve analitik teknikler olarak ikiye ayrılır. İkisi arasındaki fark yönteme göre değişmekle beraber ne kadar protein üretildiğine bağlıdır. Analitik yöntemlerde, karışım içerisinde bulunan protein tespit edilerek miktarının belirlenmesi amaçlanır. Preparatif yöntemlerde ise bir proteinin büyük miktarda üretilmesi amaçlanır. Genel olarak preparatif yöntemler analitik amaçla kullanılabilir. Protein saflaştırılması için farklı yöntemler mevcuttur. İlk defa saflaştırılacak protein hangisinin uygulanacağına kısmen deneme yanılmayla belirlenir. Alternatif yöntemler arasında karar verilirken harcanan zaman, malzemelerin masrafı ve protein kalitesi göz önünde tutulan faktörlerdendir.

SDS – PAGE Elektroforezi

SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez) biyokimyada karışımlarda bulunan yüklü molekülleri elektriksel alan varlığına göre moleküler kütleleri baz alınarak yapılan analitik bir ayrımdır. Sodyum dodesil sülfat (SDS) protein moleküllerinin tanımlanması ve izolasyonuna katkı sağlar. SDS-PAGE aynı zamanda matriks temelli olan bir jeldir. Bununla beraber SDS kullanılır. Yaklaşık olarak 1.4 gram SDS 1 gram proteine bağlanır her amino aside 2 SDS molekülü bağlanmış olur. SDS yüzey aktif madde olarak işlev görür. Proteinler kendi taşıdıkları yüklerin üzerini kaplayarak kendi yüklerini kaybetmiş olur, böylece ayrım yük temeline göre gerçekleşmemiş olur. Pozitif yükler ayırma jelinin bazik pH değeriyle yüksek oranda indirgenmiş olur. Belirli bir elektrik alan varlığında proteinler anottan katoda doğru ilerler. Bu ilerlemenin hızı moleküler kütlenin büyüklüğüyle değişir. Bu ayırmanın temeli proteinlerin moleküler kütlesine dayanır.

Kullanım Alanı

Elektroforez elektrik alanda yüklü moleküllerin ayrılması için kullanılır. Jel elektroforezi, porlu destek ortamında moleküllerin yüklerine, büyüklüklerine ve konformasyon farklılıklarına göre ayrım yapılır. Jel elektroforezinde iki farklı destek ortamı bulunur. Birincisi agaroz jel elektroforezi ikincisi de poliakrilamid jel elektroforezidir. Poliakrilamid jelin ayırma gücü agaroz jele göre daha yüksektir. Agaroz jel elektroforezi yatay sistem üzerinde gerçekleştirilir, poliakrilamid jelde dikey jel düzeneğinde gerçekleştirilir. Agaroz jeller soğuyarak jel haline gelirken poliakrilamidler polimerleşme reaksiyonu sonucu oluşur. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE), SDS poliakrilamid jel elektroforezi protein analizi oldukça zor bir yöntemdir. Prensip olarak suda çözünemeyen bütün proteinlerin ayrımı için kullanılmaktadır.

Zar proteinleri, hücresel toprak bileşenlerinde bulunan proteinlerin hepsi ve hücre iskeletindeki proteinlerin hepsi bu yöntemle ayrılabilir. Proteinler poliakrilamid jelde moleküler ağırlıklarına göre ayrılır. Proteinler amfoteriktir yani hem negatif hem de pozitif yüklere sahiptir. Proteinler SDS ile karşılaştırıldığında negatif yüklenirler. SDS proteinleri denatüre eder ve denatüre olan bütün proteinler benzer yapı gösterirler. Anyonik deterjanlara bağlandığında bütün proteinler homojen olarak dağılır ve negatif yüklenir. SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) sisteminde kesikli jel kullanılır. Örnekler yükleme jeli üzerinde dar alanda konsantre edilir. Yükleme jeli konsantrasyonu ile pH’sı düşüktür. Düşük konsantrasyon da olduğundan büyük porlar oluşur ve molekül eleme etkisi düşüktür. Yüklenen örnekler yürütme jeline geldikten sonra molekül büyüklüklerine göre ayrım yapılır. Yürütme jelinin konsantrasyonu ve pH’sı daha yüksektir. Jel hazırlanırken bazı kimyasallar kullanılır.

Bu kimyasalların kullanılma nedenleri;

Akrilamid: Jel polimerinin monomeridir. Serbest radikal polimerizasyonuyla beraber polimerize olur.
N, N’-metilen-bis (Akrilamid): Çapraz bağlayıcı olarak kullanılır ve jelleşmeyi sağlar.
SDS (Sodyum Dodesil Sülfat): Proteinleri denatüre ederek üç boyutlu yapılarını bozar doğrusal hale gelmelerini sağlar.
Tetrametilendiamin (TEMED): Serbest radikallerin kararlı hale gelmesini sağlar.
Amonyum Persülfat (APS): Serbest radikallerin yapısında bulunur ve jel oluşumunun başlamasında görev alır.
Gliserol: Örneklerin yoğunluğunu artırmak için kullanılır.
ß-Merkaptoetanol: Denatürasyona katkı sağlar ve disülfit bağlarını kırar.

Western Blot Yöntemi

Western blot immünogenetik, moleküler biyoloji ve diğer birçok alanda doku homojenatı ya da ekstrat numunesiyle spesifik proteinlerin tamınlanmasında sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Western blot tekniği 5 farklı aşamadan oluşur. Western blot da ilk adım numunenin hazırlanmasıdır. Ardından ayrılan moleküller nitroselüloz ya da poliviniliden diflorür (PVDF) zara sahip olan matriks yüzeyine aktarılır ya da lekelenir. Daha sonra, antikorlar zarın yüzeyinde herhangi bir spesifik olmayan bağlanmaları önlemek için zar bloke edilir. Genellikle proteinler antikor kombinasyonuyla problanır (işaretlenir).

İlgilenen proteine özel antikorlar ve bu antikorların konakçı türüne göre de başka bir antikor oluşturulur. Genel olarak ikincil antikorlar uygun substratla birleştiğinde saptanabilen sinyal üretilen enzim kompleksi oluşur. En hassas yöntemlerden antikora konjuge enzimle reaksiyonun yan ürünü olan ışık üreten kemilüminesan substrat kullanılabilir. Alternatif floresan sinyaliyle yakalayabilen alet kullanılarak floresan etkili antikorlar kullanılır. Kullanılan her yöntem için sinyalin yoğunluğu zar üzerinde bulunan antijenin miktarıyla bağlantılıdır. Protein saptama yönteminde antijene bağlamak için etiketlenmemiş birincil antikor kullanılır. Birincil antikor enzim ya da kloroformla konjuge olan ikincil antikor kullanılarak saptanır. Dolaylı yöntemin birçok avantajı vardır. Protein tanımlamak için membran üzerinde bulunan özgül bağlamaların tespit edilmesi için sekonder antikorlara konjuge enzimler reaksiyona girer ve sinyal oluşturacak substratlar kullanılır.

Sonuç ve Yorumlama

Görsel: Western Blot Deneyi sonucu elde edilen görüntü

Elde edilen bant sonuçlarına göre proteinin molekül ağırlığı 50 kda’dan az ya da çok protein tespit edilmiştir. En yoğun protein ise 50 kda’dadır. Elde edilen proteinin kullanılacağı çalışmalara göre bant yoğunluklarının önemi değişebilir. En yoğun bandın molekül ağırlığı 50 kda olduğu için bunu kullanmamız daha verimli sonuçlar almamıza katkı sağlar. Uygulanan aşamalar esnasında protein kayıpları yaşanabilir. Yoğunluğu fazla olan protein tercih edildiğinde deney sonuçlandığında da elimizde ölçüm yapabileceğimiz örneğimiz bulunur. A ve B grupları arasında kullanılan gliserol miktarı farklılık gösterebilir. B grubuna daha fazla gliserol kullanılmış olabilir. A ve B grupları arasında kullanılan jelin yoğunluğu farklılık gösterebilir bunun sonucunda bandın yoğunluğu da farklılık gösterir. Kullanılan jelin ayırt etme gücü düşükse proteinlerin hepsi farklılıklarına göre görüntülenebilir. Spesifik bir jel tercih edildiğinde ise istenilen protein bandı gözlemlenir. Kullanılan boyanın yoğunluğundaki farklılıklara göre de elde edilen bantta farklılıklar gözlemlenir. Yoğunluğun fazla olduğu kısımda miktar olarak da protein fazla olabilir. Saf protein elde edilmek amaçlanmışsa da yoğunluğu daha az olabilir.

Kaynaklar: