TUNEL Testi Nedir?

Tanım

Apoptozdan kaynaklanan DNA fragmentasyonunun tespitinde kullanılan floresan bir teknik olan TUNEL (terminal deoksinükleotidil transferaz kırık-uç işaretlenmesi) testi 1992’de tanımlanan, iyi bilinen ve hızlı bir yöntemdir (1, 2).

Apoptozun geç evrelerinde meydana gelen nüklear kromatin fragmentasyonu çok sayıda 3’ hidroksil uç oluşmasına sebep olur. Endonükleaz olan terminal deoksinükleotidil transferazlar (TdT), DNA kırıklarının uçlarında bulunan serbest 3’ hidroksil uçlara biyotin ya da floresan işaretli deoksiüridin trifosfat nükleotitlerin (dUTP, F-dUTP) bağlanmasını katalizlerler. TUNEL testinde kullanılan iki farklı dUTP ile işaretleme yöntemi vardır. Bunlardan ilki genelde tercih edilen direkt işaretlemedir ki isminden anlaşıldığı üzere direkt görüntü almak mümkündür. İkincisi ise bromodoksiüridin (BrdU) ile işaretlemedir. Bu yöntemde görüntü alabilmek için BrdU’ları hedefleyen antikorların kullanılması gerekmektedir (2).

**Şekil 1:** TUNEL testinde kullanılan dNTP uç işaretleme yolları (2).

**Şekil 2:** Farklı örneklerin TUNEL testi ve PI ile boyama sonrası floresan görüntüleri (5).

İşaretlenen uçlar immonuhistokimyasal yöntemlerle görüntülenebilirler. Floresan görüntü alındığında hücreler yeşil boyanmış görüneceklerdir. Tüm hücreler içerisinde apoptoza giden hücrelerin oranının bulunması için propidyum iyodid (PI) ile boyama yapılabilir. Bu sayede, tüm hücreler PI ile boyanarak floresan mikroskop altında kırmızı renkli görünür. Görüntüler üst üste konularak apoptoza giden hücre oranı tespit edilebilir (3,4).

TUNEL testi ile fragmente olmuş DNA’nın tespiti, ‘DNA ladder’ yöntemine göre daha hassas olsa da unutulmaması gereken nokta; DNA’nın nekroz ya da farklı toksik maddelerin etkisi ile de fragmente olabileceğidir. Bu sebeple TUNEL ile beraber yapılacak farklı testler ile de onaylanması önemlidir (2,3).

Kaynaklar:

Ferreira, A., Afreen, S., Methods in Cell Biology, Chapter 13-Methods related to studying tau fragmentation, Volume 141, 2017, Pages 245-258, Edited by Stuart C. Feinstein, Nichole E. LaPointe
Majtnerová, P., & Roušar, T. (2018). An overview of apoptosis assays detecting DNA fragmentation. Molecular biology reports, 45(5), 1469-1478.
Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., & Kioussi, C. (2012). Detection of apoptosis by TUNEL assay. In Odontogenesis (pp. 41-47). Humana Press.
Kabakov, A. E., & Gabai, V. L. (2018). Cell death and survival assays. In Chaperones (pp. 107-127). Humana Press, New York, NY.
Bhattacharyya, S., Ghosh, S., & Sil, P. C. (2014). Amelioration of aspirin induced oxidative impairment and apoptotic cell death by a novel antioxidant protein molecule isolated from the herb Phyllanthus niruri. PLoS One, 9(2), e89026.