CRISPR CAS-9'ın Prime Düzenleme Versiyonu

CRISPR Cas-9 Prime Nedir?

Bu yazıda, sitemizde ayrıntılı anlatımları mevcut olan yüzyılın gen mühendisliği teknolojisi CRISPR’da önemli bir gelişmeyi daha inceleyeceğiz. CRISPR Cas9 sistemine sgRNA’in eşlik ettiği nobel ödüllü sistemde cas9, DNA’da çift zincir kırınımlarına neden olur ve bu kırınımlar en iyi yöntemle HDR (homoloji odaklı onarım) mekanizması ile onarılır. Özellikle tedavi odaklı hücre çalışmalarında gayet verimsiz olan HDR onarım mekanizması, eksojen (dışsal) donör DNA şablonlarına bağlı olduğu için uç birleştirme onarımlarından daha fazla indeller (insertion-deletions) üretir. Klasik Cas9 proteinine bir ters transkriptaz enzimi ile pegRNA (prime düzenleme kılavuz RNA)’ nın eşlik ettiği, çift DNA zinciri kırınımlarına ve HDR onarım mekanizmalarına gerek duymadan gen düzenlemesini yüksek hedeflemeyle tamamlayan yeni sistem ise 2019 yılında profesör David Liu’nun laboratuvarında doktora sonrası bir araştırmacı olan Andrew Anzalone ve ekibi tarafından bulunup Nature dergisinde yayınladıkları makale ile CRISPR PRIME olarak tanıtılmıştır.

Bağlanma bölgesi ve düzenleme sekanslarını bulunduran bir pegRNA, Cas9 ve ters transkriptaz enzimlerinden oluşan kompleksi hedef DNA’da istenilen hedef sekansına taşır. CRISPR Cas9 kompleksi, pegRNA bağlanma bölgesi rehberliğinde DNA zincirinin düzenlenecek parçasına bağlanır. Daha sonra Cas9 enzimi bağlandığı DNA’nın tek zincirini keser ve pegRNA’daki düzenlenmiş sekanslara uygun olarak tek iplikli bir RNA molekülü okuyan ters transkriptaz enzimi ise yeni tek iplikli DNA’yı üretir. Ardından hücresel endonükleaz enzimi ise son dokunuşları yapmak üzere DNA’dan kesilmiş kısmı parçalar ve üretilen yeni ipliği zincire sabitler. DNA zincirindeki istenilen bazlarla düzenlenmiş yeni ipliğin karşısındaki eski iplik bir hata olarak algılanır ve prime kompleksi yeni bir pegRNA ile karşı ipliğe bağlanıp kesme işlemini tamamlar. Eski iplik kesildikten sonra DNA zinciri kendisini düzenlenen ipliğe göre tamamlar ve böylece CRISPR Prime sistemi teoride kusursuz bir çalışma sergiler.

Tedavi Çalışmaları

İnsan embriyonik böbrek hücrelerini ifade eden HEK293T hücre hattı üzerinde yapılan laboratuvar deneyleri ile yeni sistemin orak hücre ve Tay-Sach hastalığı gibi genetik mutasyonları düzeltebildiği raporlanmıştır. Araştırmacılar, ilk olarak prime düzenleme ile gözlemlenecek hastalıklara neden olan mutasyonları in vitro ortamda HEK293T hücrelerine yerleştirdiler. Daha sonra, orak hücre ve Tay-Sach hastalığına sahip olan hücre hattından ilgili mutasyonları düzeltmek için hücrelere sekansları düzenlenmiş pegRNA eşliğinde CRISPR Prime kompleksini göndererek büyük oranda mutasyonları düzeltmeyi başardılar. Bunun yanında, araştırmacılar prime düzenleme ile insan hücreleri üzerinde 175’ten fazla düzenleme yaptıklarını raporladılar. Ancak her şeye rağmen, çok yaygın kullanılan birkaç hücre tipi ve az sayıda hastalık üzerinde çalışıldığı için klinik çalışmalara henüz uygun değildir. CRISPR gibi gen mühendisliği uygulamaları daha komplike ve daha fazla risk barındırdığı için diğer klinik tedavi yöntemlerinde olduğundan daha fazla veriye ve daha çok test edilmeye ihtiyacı vardır. Verilerin yeterli ve güvenilir olduğu bir gelecekte ise prime düzenleme sisteminin, bilinen genetik hastalıkların %89’unu düzenleyebileceği belirtiliyor. Gelecekte etkisi ve güvenilirliği artacak olan gen düzenleme araçlarına karşın genetik hastalıklarının beklenmeyen bir artış göstermemesi ümit ediliyor.