Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi (HPLC)

Giriş

Kromatografik yöntemlerin keşfi (19. yy’de öncül çalışmalar yapan farklı bilim insanları olmasına karşın) 1901’de bitki pigmentlerini bugün kullanılan sisteme benzer bir şekilde ayıran Rus botanikçi Mikhail S. Tsvet’e atfedilir. Kromatografi, durağan faz (katı veya sıvı) üzerine sabitlenmiş olan karışımdaki moleküllerin, hareketli (mobil) faz yardımıyla durağan faz üzerinde farklı hızlarla hareket etmesi (sürüklenmesi, ayrılması) temeline dayanmaktadır. Kimyasal bileşiklerin ayrılmasında sıklıkla başvurulan bir yöntem olan kromatografi, küçük moleküllerin tanımlanmasında oldukça efektiftir. Biyoloji, biyokimya, ilaç sanayii, ziraat ve daha birçok farklı alanda kullanılmaktadır.

Hareketli ve sabit fazın özelliklerine, ayrılma mekanizmasına ve kullanılan tekniğe göre birbirinden farklı kromatografik teknikler bulunmakla beraber özellikle kolon kromatografisi protein saflaştırmada en çok kullanılan yöntemdir. Bu yöntemde dikey konumda bulunan kolona durağan faz yüklenir ve hareketli faz kolondan geçirilir. İşlem atmosferik basınçta gerçekleştirilir. Bu sayede karışımda bulunan maddeler sahip oldukları özelliklere göre farklı hızlarda hareket ederler ve ayrışırlar.

Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC), kolon kromatografisi ile aynı temelde çalışmakla beraber, klasik kolon kromatografisinden farklı olarak homojen yapılı ve çok küçük tanecikli matrikslerle çalışılan bir sıvı kromatografisidir. Ayrıca bu yöntemde hareketli faz kolondan 400 ile 500 arası atmosferik basınç altında ve yüksek hızda (0.1 – 5.0 cm/sn) geçer. Bu sayede HPLC daha kısa sürede çok daha verimli ayrıştırma yapma imkânı sağlar. HPLC cihazının temel bileşenleri şunlardır; mobil faz (çözücü) şişeleri, pompa, kolon, dedektör. Bileşenler ayrıldıktan sonra miktar tayini için dedektörler kullanılır ve elde edilen kromatogramlar bilgisayar ortamında değerlendirilebilir.

Kaynaklar: 

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5206469/#ref25
2. https://www.britannica.com/science/chromatography/Efficiency-and-resolution
3. https://dergipark.org.tr/tr/download/article-file/666394
4. Arda, N., Temizkan, G., “Temel ve İleri Moleküler Biyoloji Yöntemleri”, Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul, 2017

Görsel Kaynaklar:

1. https://yandex.com.tr/gorsel/search?text=kolon%20kromatografisi&pos=2&img_url=https%3A%2F%2Fimage3.slideserve.com%2F6967394%2Fkolon-kromatografisi-l.jpg&rpt=simage
2. https://yandex.com.tr/gorsel/search?text=hplc&pos=17&img_url=https%3A%2F%2Fnanoabzar.com%2Fwp-content%2Fuploads%2F2017%2F02%2FPic3.jpg&rpt=simage
3. https://yandex.com.tr/gorsel/search?text=hplc%20hd&iorient=horizontal&pos=12&img_url=https%3A%2F%2Fwww.atlanchimpharma.com%2Fwp-content%2Fuploads%2F2016%2F04%2FUHPLC-Thermo_2.jpg&rpt=simage&rlt_url=https%3A%2F%2Fi.ytimg.com%2Fvi%2FzH7g32JOfVU%2Fmaxresdefault.jpg&ogl_url=https%3A%2F%2Fwww.atlanchimpharma.com%2Fwp-content%2Fuploads%2F2016%2F04%2FUHPLC-Thermo_2.jpg

Editör: Berfin Sucu