Multipleks PCR

Tanım

Multipleks PCR metodu, PCR metotları içerisinde en yaygın kullanılan ve en çok tercih edilen PCR metotlarından birisidir. Multipleks PCR’ın bu denli fazla tercih edilmesinin sebebi, 1’den daha fazla sayıdaki DNA sekanslarının bir tüp içerisinde ve tek bir reaksiyon işleminde kolayca çoğaltılabilmesidir [1]. Bu işlem, geleneksel PCR yöntemlerine göre hem pratiktir, zamandan ve efordan tasarruf eder hem de maliyet açısından da uygundur [1]. Fazla sayıdaki DNA sekanslarının birbirleri ile aynı olmasına gerek yoktur, zira farklı uzunluktaki ve farklı dizilime sahip çeşitli DNA sekansları, kendilerine ait olan primer çiftleri ile birlikte tek bir tüp içerisinde çoğaltılabilmektedir. Farklı DNA sekanslarının çoğaltılmasında dikkat edilecek hususların başında bu farklı DNA sekanslarına ait uygun primer çiftlerinin dizayn edilmesi ve optimizasyon işlemlerinin yapılması gelmektedir [1]. Farklı sayıda DNA sekansının ve primer çiftlerinin varlığı primer-dimer oluşumu gibi istenmeyen yan etkilerin görülmesine yol açabilmektedir. Bu bakımdan primer dizaynı kritik önem arz etmektedir [2]. Prime dizaynına ayrıntılı bakıldığında, geleneksel PCR yöntemlerinde optimize edilen primer özellikleri Multipleks PCR yönteminde de bulunmaktadır. Kullanılan ön ve arka primerlerin birbirleri arasındaki erime sıcaklığı farkının mümkün olduğunca az olması, primerlerin birbirlerinin tamamlayıcıları olmaması gibi etmenler aynı şekilde bu PCR metodunda da geçerlidir [1].

Multipleks PCR’da elde edilen amplikonların birbirleri arasındaki farkı en bariz şekilde gösteren özelliği boyutlarıdır. Amplifiye edilmek istenen iki farklı DNA sekansının boyutları birbirinden farklı olmak zorundadır. Zira, elde edilen amplikonların benzer uzunlukta olmaları sonuçlarda belirsizliklere yol açabilmektedir [1]. Yine de yapılacak sekanslama yöntemleri ile de elde edilen amplikonların hangi DNA sekansına ait olduğu tespit edilebilmektedir. Fakat bu süreç, uzun ve yorucu olabilmektedir. Hem zaman hem de efor tasarrufu için bu duruma dikkat edilmesinde fayda vardır.

**Şekil 1:** Multipleks PCR metodu. Şekilde görüldüğü üzere, 4 farklı suşa ait DNA dizileri, tek bir tüpte ve tek bir reaksiyonda çoğaltılabilmektedir. Çoğaltılan DNA dizileri jel elektroferezinde yürütüldükten sonra marker boyutlarına kıyaslanarak uzunlukları belirlenebilmektedir [3].

Multipleks PCR metodunun kullanım alanı oldukça geniştir. Multipleks PCR, mikrobiyoloji çalışmalarında viral ve bakteriyal antijenlerin tespit edilmesinde kullanılmaktadır [4]. Özellikle birden fazla patojenin olduğu düşünülen tek bir örnek içerisindeki patojenlerin miktarı ve yapıları tespit edilebilmektedir. Her ne kadar birçok avantajı olduğu bilinse de, Multipleks PCR’ın bir dezavantajı da tek primer PCR metoduna göre duyarlılığının daha az olmasıdır [1]. Birden fazla DNA dizisinin çoğaltılması ile elde edilen DNA dizisi tek primer PCR metoduna göre daha az duyarlıdır. Bu durum, Multipleks PCR’ın DNA dizilerinin çoğaltılmasında tek primer PCR’a nazaran birtakım hataların ve bozuklukların gelişmesine daha açık olduğu anlamına gelmektedir.

Multipleks PCR’ın en önemli avantajlarından birisi ise, birden fazla DNA dizisine ait primer dizilerinin kullanılmasının, yanıltıcı pozitif ve negatif durumları minimalize etmesidir [1]. Çünkü kullanılan primer setleri belirli DNA dizilerine aittir ve belirsizlik durumu tek primerli PCR metoduna göre biraz daha az olduğu söylenebilmektedir.

Multipleks PCR’ın keşfi 1980’li yıllara dayanmaktadır. 1988 yılında steroid sülfataz geni aracılı ile distrofin geninde var olan delesyonların incelenmesi neticesinde ortaya çıkmıştır. 2008 yılına gelindiğinde, Multipleks PCR, mikrosatellitlerin ve Tek Nükleotit Polimorfizm (TNP) durumlarının tespit edilmesinde kullanılmaya başlanmıştır [5].

**Şekil 2: a)** Tek kalıp PCR metodunda kullanılan bir primer seti mevcuttur ve elde edilen amplikon, tek DNA dizisinden elde edilen belirli bölgenin amplikonudur. b) Multipleks PCR birden fazla DNA dizisinde yer alan belirli bölgelerin aynı anda, tek bir rekasiyonda çoğaltılmasına izin verir. Sonuç olarak üç farklı diziden amplikonlar elde edilmiş olur. c) Çoklu kalıp PCR metodu, var olan tek bir genin farklı alellerinin çoğaltılması işlemine dayalıdır [6].

**Şekil 3:** Multipleks PCR metodu, ekolojik çalışmalarda da sıkça kullanılmaktadır. Şekilde görüldüğü üzere, var olan üç farklı gergedan türünden birine ait olduğu düşünülen örnek, üç farklı primer setleri kullanılarak tek bir tüp içerisine yerleştirilmektedir. Buradaki amaç eldeki örnekte var olan DNA dizisinin hangi gergedan türüne ait olduğu tespit edilmesidir. Sonuç olarak, örnekte var olan DNA dizisi bu üç primer setinden birisiyle etkileşime girecek ve çoğaltma işlemi gerçekleşecektir. Bunun sağlaması ise jel elektroferezinde örneğin yürütülmesi ile sağlanmaktadır. %2 agaroz jelin kullanıldığı jel yürütmesinde elde edilen amplikon görülebilmektedir. Ayrıca, önceden elde edilen veriler ve eldeki mevcut DNA merdiveni aracılığı ile de amplikon’un uzunluğu hakkında da bilgi sahibi olunabilmektedir [7].

Kaynaklar:

Shen, C.-H. (2019). Amplification of Nucleic Acids. Diagnostic Molecular Biology, 215–247. doi:10.1016/b978-0-12-802823-0.00009-2
V. García-Cañas, R. González and A. Cifuentes, Tr. Anal. Chem., 23 (2004) 637.
Multiplex PCR: An overview of multiplex PCR assay, primer design for multiplexing, primer design software for multiplex PCR. (2021). Retrieved 7 September 2021, from http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/multiplex-pcr.html
Naum, M., & Lampel, K. A. (2011). Analytical Methods | DNA-Based Assays. Encyclopedia of Dairy Sciences, 221–225. doi:10.1016/b978-0-12-374407-4.00022-4
Bartlett, J. M., & Stirling, D. (2003). A short history of the polymerase chain reaction. In PCR protocols (pp. 3–6). Humana Press.
Kalle, E., Kubista, M., & Rensing, C. (2014). Multi-template polymerase chain reaction. Biomolecular Detection and Quantification, 2, 11–29. doi:10.1016/j.bdq.2014.11.002
Ewart, K. M., Frankham, G. J., McEwing, R., The, D. T., Hogg, C. J., Wade, C., … Johnson, R. N. (2018). A rapid multiplex PCR assay for presumptive species identification of rhinoceros horns and its implementation in Vietnam. PLOS ONE, 13(6), e0198565. doi:10.1371/journal.pone.0198565

Görsel Kaynak: https://www.tekscan.com/blog/pressure-mapping/proving-secure-dna-sample-containment-high-efficiency-pcr-molecular-diagnostic

Editör: Meryem Melisa KAR